Г.Е. Афиногенов д.м.н., профессор, А.Г. Афиногенова к.ф.н, Е.Н. Доровская ФГУ «РНИИТО им.Р.Р. Вредена Росздрава», Санкт-Петербург, А.В. Гроссер, ООО WDS, Москва

Полученные в процессе клинических исследований зубной пасты R.O.C.S. данные о значительном улучшении гигиенического состоянии полости рта, отмеченная и исследователями и испытуемыми задержка скорости отложения зубного налета [1, 2] побудили нас к проведению дополнительных исследований влияния протеолитического фермента бромелаина (одного из ключевых компонентов запатентованного состава) на антиадгезивные свойства зубной пасты R.O.C.S.

Установление взаимодействия между патогенном и клеткой-мишенью в результате бактериальной адгезии является определяющим звеном в ходе инфекционного про¬цесса. Прикрепление и последующее размножение микроорга¬низмов с образованием микроколоний и/или пленки обеспечи¬вает им более выгодные условия существования, связанные, в частности, с противодействием механическому удалению бак¬терий из макроорганизма. Доказано, что адгезивность болезне¬творных микроорганизмов часто коррелирует с их патогенностью и вирулентностью. Так, на авирулентном штамме Escherichia coli, было продемонстрировано, что перенесенная плазмида, контролирующая синтез антигена К88, усиливает не только адгезию микроорганизмов к щеточной каемке энтероцитов, но и вирулентность экспериментально изменен¬ного штамма [3, 4, 5]. Адгезия E.Coli к уроэпителию приводит не только к механическому закреплению микроорганизма в новой экологической нише, но и вызывает адекватную новым условиям перестройку метаболизма. Кроме перестройки метаболизма, механический контакт и связывание Р-ворсинок с клеткой эпителия ведут к изменению механизма сборки новых ворсинок (они становятся короче) и являются сигналом к экспрессии ряда генов вирулентности E.coli (комплекса рар и гемолизина) [6].
Молекулярный механизм бактериальной адгезии является универсальным для патогенных и комменсальных форм, что подтверждено на примере микрофлоры верхних дыхательных путей, нижних отделов пищеварительного и мочеполового трактов [7]. Основой взаимодействия любых биоло¬гических систем и межклеточных коммуникаций служит лиганд-рецепторное узнавание [8, 9], при котором меньший по размерам и молекулярной массе участник называют лигандом (например, поверхностные структуры клеточной стенки бактерий), а его более крупный комплементарный партнер — рецептором (например, сайты свя¬зывания на цитолемме эукариотической клетки).
Лиганды и рецепторы представляют собой полимеры гликолипидной или гликопротеинной природы, состоящие из множе¬ственных копий уникальных в каждом случае субъединиц и определяющие тропизм различных патогенов к своим клеткам-мишеням [10]. Именно последнее обстоятельство способствует колонизации бакте¬риями тканей макроорганизма с повышенной плотностью ре¬цепторов [9]. In vivo на процесс адгезии существенное влияние оказывают растворенные компоненты биологических жидкостей и секретов, с которыми патогены чаще встречаются до контактов с клетками-мишенями и кото¬рые по химическому строению аналогичны клеточным рецепто¬рам. Orksov a. Birch-Anderson (1980) [11] продемонстрировали, что Е. coli адгезируют к муцину слюны раньше, чем к эпителию ротовой полости. Способностью адсорбировать белковые компоненты слюны обладают стрептококки полости рта (Streptococcus sanguis, S. Mitis, S. Salivarius), причем в исследовании было показано, что нарушить эту адгезию возможно с помощью протеолитического фермента трипсина [12].
Показатели адгезии как многофакторного процесса зависят от большого числа условий, как со стороны бактерий, так и макроорганизма. Известно, что видовая принадлежность в значительной степени характеризует адгезивные свойства бактерий. Так, Streptococcus mutans практически не фикси¬руется на эпителиоцитах языка и щек, но необратимо прикреп¬ляется к поверхности зубов [13]. Arbuth¬nott a. Smith (1979)[5] отмечают, что адгезивность St. pyogenes к эпителиальным клеткам ротовой полости в 6 раз выше, чем у Е. coli. Для це¬лого ряда микроорганизмов показана прямая связь степени гидрофобности клеточной поверхности и адгезивности. Так, St. aureus из гнойных очагов более гидрофобен, чем из окру¬жающей среды, полости носа, поверхности кожи [4].
К факторам, влияющим на адгезивные свойства тканей и клеток хозяина, относится индивидуальное состояние пациен¬та: высокая степень колонизации эпителиоцитов ротовой по¬лости Str. pyogenes у больных различными воспалительными заболеваниями, снижение этого показателя у носителей и прак¬тически полное отсутствие у здоровых людей [4]. Существует разница в прикреплении микроорганизмов к раз¬ным участкам в пределах одного макроорганизма. Для Str. salivarus и St. aureus нижняя поверхность языка рассматри¬вается как богатая рецепторами зона и наиболее благоприятная для инвазии область [13]. На вариабельность рецепторного аппарата эпителиоцитов может оказывать влияние и гетерогенность клеточной популяции, обусловленная физиологическими изменениями поверхностных структур клеток при дифференциации или старении. Патологические изменения тканей макроорганизма создают дополнительные условия, способствующие адгезии микроорганизмов [14].
Изучение молекулярной природы лиганд-рецепторных комплексов, образующихся при взаимодействии различных бактерий с соответствующими им клетками-мишенями, а также факторов, влияющих на процесс адгезии in vivo и in vitro, позволяет разработать профилактические меры, направленные на подав¬ление ранних этапов инфекционного процесса.
В основе поисков антиадгезивных препаратов лежит созда¬ние эффективных препятствий с разнообразными механизмами действия при установлении взаимодействия между лигандами и рецепторами. Одним из наиболее известных механизмов, с учетом которого осуществляется подбор ингибиторов процесса адгезии, является введение в систему бактерии – эукариотические клетки растворимых веществ, конкурирующих с лигандами или рецепторами за места связывания на клеточных поверхностях [9]. При этом все растворимые соединения можно разделить на две группы, способные реагировать либо с бактериальными, либо с эукариотическими клетками. Изби¬рательное связывание лигандов микроорганизмов предпочти¬тельнее, так как в меньшей степени влияет на рецепторный аппарат клеток-мишеней, а через него на самые разнообразные процессы в тканях макроорганизма [15].
К настоящему времени известны многочисленные экспери¬ментальные доказательства того, что применение природных или синтетических аналогов клеточных рецепторов и компонентов тканевых жидкостей способно значительно снизить, а в отдельных случаях и полностью предотвратить прикрепление микроорганизмов к клеткам хозяина [9, 15, 16]. Установлены факты взаимодействия бактериальных лигандов с белками, гликопротеинами плазмы крови (иммуноглобулинами классов А и G, р2-микроглобулином, фибриногеном, фибронектином, альбуми¬ном, трансферрином, а также некоторыми другими [4, 16, 17], мочи (ТН-белком) [18,19], слюны (муцином, агглютининами) [20], что позволило использовать большинство из перечисленных выше соединений в экспериментальных и клинических условиях в качестве ингибиторов бактериальной адгезии. Сегодня имеются данные об антиадгезивном действии экзогенных протеолитических ферментов. Действие ферментов не ограничивается изменением характера прилипания бактерий к мишени, но и приводит к нарушению уже сформированных колоний. Разные ферменты демонстрируют различный уровень эффективности. Результаты аналитических исследований указывают на специфичность такого влияния. [21]

Задачей настоящего исследования было оценить влияние зубной пасты, содержащей бромелаин на адгезию микроорганизмов, обитающих в полости рта человека.

Материалы и методы.
Материалы:
Исследована зубная паста R.О.С.S. включающая бромелаин.
Контролем служила зубная паста аналогичной рецептуры без бромелаина.
Исследование проводилось слепым методом. Тестируемые образцы были обозначены условными номерами 56 (R.O.C.S.) и 57 (контроль).

Тест-культуры микроорганизмов:
Клинические штаммы микроорганизмов, выделенные из ротовой полости волонтеров: Staphylococcus aureus 20, Streptococcus salivarius 67, Streptococcus sangius 12, Streptococcus sobrinius 83.

Культура клеток: кожно-мышечных фибробластов эмбриона человека.
Оборудование: бактериологические анализаторы – IEMS-фотометр фирмы LabSystems (Финляндия), BBL Crystal фирмы Becton Dickenson (США); система ввода изображений «Видео-ТЕСТ-морфология» (Германия).

Методы.
Микробиологические, морфологические.
Все исследования проводили в 3-х повторениях.

1-ый этап.
Путем прямого посева тампоном из полости рта у 10 волонтеров на 5% кровяной агар получены чистые культуры микроорганизмов Staphylococcus aureus 20, Streptococcus salivarius 67, Streptococcus sangius 12, Streptococcus sobrinius 83.
Полученные штаммы были идентифицированы на вышеперечисленных бактериологических анализаторах.

2-ой этап.
Изучена антиадгезивная активность тестируемых паст на культуре клеток (КК) кожно-мышечных фибробластов эмбриона человека. Фибробласты выращивали в пробирках Лейтона на покровных стеклах в ростовой питательной среде Игла 24 часа при 37 град. С до образования конфлюэнтного монослоя по методике Грабовской К.Б., Тотолян А.А., 1977 [22].
Затем ростовую среду сливали и добавляли по 1,8 мл тестируемых образцов паст и по 0,2 мл суточной культуры соответствующего тест-штамма в дозе 10 в восьмой степени КОЕ/мл и инкубировали 2 часа при 37 град. С.
После инкубации клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой среды Игла, фиксируют 96 этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимза и исследуют микроскопически.
Опыты по оценке подавления адгезии тест-штаммов тестируемыми пастами проводили с разведением каждой пасты 1:20000 в присутствии 50% сыворотки человека.
Интенсивность процесса адгезии тест-штамма оценивали по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя – микробную нагрузку (МН) – определяют по формуле МН= ИА х ПК%.
Степень адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.
В опыте использовали 2 экспозиции – 2 часа и 3 минуты с концентрацией 1:20000, практически не вызывающей повреждения монослоя клеток. (рис. 1, 2, 3, 4) Как видно из таблицы 1, препараты 56 и 57 недостаточно интенсивно подавляли адгезию тест-микроорганизмов при экспозиции 2 часа - % подавления адгезии составил соответственно в отношении:
- S.aureus – 28% и 16%;
- Str.salivarius – 30% и 17%;
- Str.sangius – 26% и 13%;
- Str.sobrinius – 31% и 17%.

Как видно из таблицы 2, при сокращении времени экспозиции до 3 минут эффективность препаратов 56 и 57 резко повышалась - % подавления адгезии составил соответственно в отношении:
- S.aureus – 80% и 70%;
- Str.salivarius – 80% и 70%;
- Str.sangius – 83% и 72%;
- Str.sobrinius – 79% и 67%.

Во всех случаях препарат 56 (R.O.C.S. с бромелаином) был более эффективен, чем препарат 57.


Заключение
Эффективность препаратов для подавления адгезии нормальной микробиоты ротовой полости зависит от экспозиции: при 2-часовой экспозиции эффективность зубных паст невысокая, а при времени выдержки 3 минуты – она резко возрастает – до 70-80% подавления адгезии штаммов микроорганизмов. При этом 3 минуты – обычное время для чистки зубов. Это, по-видимому, связано с обратимостью адгезии в короткие сроки после внесения штаммов в модельную систему, т.к. обычно через 1-2 часа адгезия становится необратимой.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности разработки данных рецептур, особенно препарата 56 (зубная паста R.O.C.S. с бромелаином), как средств для профилактики формирования микробной биопленки в полости рта.

Таблица 1. Адгезивная активность тест-штаммов в присутствии тестируемых паст 56 («РОКС») и 57 (контроль) при экспозиции 2 часа


Таблица 2. Адгезивная активность тест-штаммов в присутствии тестируемых паст 56 (R.O.C.S) и 57 (контроль) при экспозиции 3 минуты






Список литературы:
1. Сарап Л.Р с соавт. Гигиенический уход при заболеваниях пародонта.// Клиническая стоматология -2005 - №3 (35) - С.30-32

2. Кунин А.А. с соавт. Сравнительный анализ влияния зубных паст на кариесрезистентность эмали зубов. // Клиническая стоматология - 2005 - №4 (36) - С. 60-63

3. Овод В. В., Вершигора А. Е., 1982; Адгезивность бактерий // Успехи соврем. Биол. -1982-т.94, №2 - С.313-324

4. Wadstrom Т., Molecular aspects on pathogenesis of wound and foreing body infections due to staphylococci // Zbl Bacteriol Hyg Ser A. -1987.-Bd.266, H. 1-2. – S. 191-211.

5. Arbuthnott J.P., Smith C.J. Bacterial adhesion by host/ pathogen interaction in animals // Adhesion of microorganisms to surface. –London- New York -1979- p. 165-198.

6. Сидоренко С.В. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом // клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – №4 (3) – 2001, с.301 -315

7. Costerton J., 1982. – Цит. по Schoolnik et al., 1987.

8. Костюкова Н. Н. Начальный этап инфекционного процесса – канонизация и пути ее предотвращения // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. – 1989. - № 9. - С. 103-110.

9. Schoolnik et al. Molecular approach for the study of uropathogenesis // Bacteria-Host Cell Interaction. – N.Y., 1987. – P. 201-211.

10. Петровская В. Г., Бондаренко В. М. Влияние катионных белков клеток крови человека на рост Escherichia coli. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. – 1990. - № 5 – С. 110-117.

11. Orksov I.., Birch-Anderson A. Comparison of Escherichia coli fimbrial antigen with type 1 fimbrial // Infect Immun. – 1980. – W. 27, N 1. – P. 657-666.

12. Tamura M et al. Adsorption of salivary proteins to the surface of oral streptococcal cells. // J Nihon Univ Sch Dent. -1994- Dec;36(4) – с. 276-82.

13. Williams R.C., Gibbons R.J. Inhibition of streptococcal attachment to receptors of human buccal epithelial cells by antigenically similar salivary glycoproteins // Infect Immun.- 1975. – V. 11. – P. 711-718.

14. Быков В. Л. с соавт. Адгезивные взаимодействия грибов рода Candida с эпителиальными клетками слизистых оболочек человека. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. – - 1985. - № 10. – С. 88-94.

15. Matrosovich M.N. Towards the development of antimicrobial drugs acting by inhibition of pathogen attachment to host cells: a need of polyvalency // FEBS Letters. – 1989. – V. 252, n. 1-2. – P. 1-4.

16. Lammler C., Frede C. Binding of IgG and albumin to Streptococcus dysgalactial / Zbl. Bacteriol. Hyg. – Ser. A. – 1989. – Bd. 271, H. 3. – S. 321-329.

17. Jarnall M., Widders P.R. Comparison of SgG Fe-receptors from clinical isolates of streptococcus zooepidemicus // J. Med. Microbiol. – 1989. – V. 28, p. 2. – P. 137-141.

18. Tamm I., Horsfall F. A mucoprotein derived from human urine which reacts with influenza, mumps, and Newcastle disease viruses // J Exp Med. - 1952. – V. 95, N 1. – P.

19. Duncan J. L. Differential effect of Tamm-Hossfall protein (TH-protein) on adherence of Escherichia coli to transitional epithelial cells // J. Infect. Dis. – 1988. – V. 158, N 6. – P. 1379-1382.

20. Michaler S. M. et al. Ingestion of Streptococcus mutans induces secretory IgA and carries immunity / S. M. Michaelek, J. R. MaGhee, J. M. Mestecky et al. // Science. – 1976. – V. 191, N 2. – P. 1239-1240.

21. В. В. Тец с соавт. Влияние экзогенных протеолитических ферментов на бактерии http://mucos.com.ua/menu/10stati.htm]

22. Грабовская К.Б., Тотолян А.А. // Журн. Микробиол. – 1977. - №2. – С.32-36


Источник: http://www.medicus.ru/?cont=article&art_id=11188

Подпишитесь на нашу рассылку:
Всё для создания бизнеса: идеи, технологии, изобретения. Деловая информация

Вас ждёт море отборной информации для создания своего бизнеса. Статьи "генераторов идей", изобретателей, а также комментарии многих тысяч наших подписчиков! Лучшая рассылка о бизнесе.

см. также:
• Программа для расчёта эффективности планируемого бизнеса, срока окупаемости, прибыли, точки безубыточности»»»
• Магазин технологий»»»
Предлагаем очень интересный каталог технологий - описание, фотографии, схемы, секреты, чертежи. Начните свой бизнес сегодня!